Os inibidores do proteassoma promovem morte celular em células de mamíferos por processo descrito, em muitos casos (dependendo de linhagem celular e dose), como apoptose. Esta atividade por parte de inibidores específicos da protease tem sido explorada como potencialmente benéfica na quimioterapia de diversos tumores incluindo-se os sólidos e hematológicos. Com destaque na literatura científica recente está o inibidor sintético denominado de bortezomibe recentemente introduzido na clínica médica. A presente proposta de trabalho tem por objetivo identificar dentre os produtos naturais disponibilizados pelo programa BIOTA e dentre toxinas animais disponíveis no Institutto Butantan, compostos que sejam inibidores específicos do proteassoma 20S. A metodologia a ser utilizada implica em microensaios e prevê o screening de extratos fracionados e derivados isolados. Consistirá na medida da atividade do proteassoma na presença desses produtos por intermédio de ensaios em microplacas, sendo que o proteassoma será isolado de uma linhagem de S. cerevisiae onde uma das subunidades do complexo catalítico 20S é modificada com uma cauda de poli-histidina e seqüência FLAG o que permite a purificação do complexo 20S em poucas horas. A segunda fase do projeto prevê o estudo da especificidade dos inibidores potenciais encontrados na primeira etapa. A especificidade dos inibidores será avaliada por meio de ensaios de imunoprecipitação e de cinética enzimática. Após a identificação e seleção dos inibidores específicos do proteassoma, será feita avaliação da atividade pró-apoptótica desses compostos. Os ensaios nessa fase do projeto serão realizados em cultura de células tumorais de diversas linhagens onde será avaliada a viabilidade celular e feita a caracterização do processo apoptótico por meio de ensaios já consolidados na literatura.

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abstract

       Proteolysis by the proteasome is inhibited by specific inhibitors since proteasomal active site differs from any other protease known thus far (it is a threonine protease). Cell death is observed when tumor cell lines or differentiated cultured cells are incubated in the presence of proteasome inhibitors. In many of those reports the cell death has been identified as apoptosis. These findings motivated a series of studies upon the utilization of specific proteasome inhibitors as anti-tumor agents. Such studies led to the selection of a few synthetic proteasome inhibitors for clinical trials in a variety of tumor types, including hematological and solid tumors malignancies. Preclinical and phases I and II of human trials have demonstrated that proteasome inhibitors are a potentially promising class of anti-tumor agents. Bortezomibe is the first among those compounds to be introduced in anti-tumor therapy (2004). In addition to anti-tumor effects, proteasome inhibitors may also have applications for diseases caused or exacerbated by inflammation.

        It is noteworthy the increasing reports in the literature on searching for proteasome inhibitors among natural products. Thereby, the goal of present proposal is the screening of potential specific proteasome inhibitors from extracts or pure compounds derived from natural sources available in REDEBIO network and from animal toxins available in the Instituto Butantan. The screening and the identification of specificity will be followed by the evaluation of the ability for triggering apoptosis in cultured tumor cells. Cell viability and the determination of apoptosis induction are among the assays selected to identify potential anti-tumor compounds.

        Methodology utilized for the screening will be the proteasomal activity determination in microplates by fluorescence technique. The proteasome will be isolated from a strain of the yeast S. cerevisiae that possesses the pre1 20S proteasome subunit tagged with a poly-his and a FLAG peptide sequence. Assays to determine specificity will be performed by immunoprecipitation with the anti-FLAG antibody. Compounds selected by their selectivity will be assayed into cell culture for the pro-apoptotic effect.